بررسی خواص بیولوژیک دی ازوتروف های همیار و برهمکنش آنها با باکتری سلولوموناس

در این بررسی شش جدایه شامل سه جدایه از ریشه سه رقم برنج (جدایه های pxr1، pxr2 و str1 ) و سه جدایه از ریشه سه رقم گندم (جدایه های pxw1، pxw2 و pxw3) به صورت اندوفیت جداسازی و با استفاده از آزمایشات فنوتیپی شامل آزمون های افتراقی بیوشیمیایی، تعیین نیم رخ کل پروتئین های سلول، طیف سنجی مادون قرمز تبدیل فوریه و همچنین آنالیزهای ژنوتیپی نظیر pcr ژن 16s rdna و نیم رخ پلاسمیدی، تمام جدایه ها به غیر از جدایه str1 سودوزانتوموناس شناسایی شدند. مقایسه روش های فوق الذکر نشان داد که دو جدایه برنج (pxr1 و pxr2) و همچنین دو جدایه گندم (pxw1 و pxw2) به یکدیگر شبیه و جزء یک گونه و آن هم گونه جدیدی از سودوزانتوموناس محسوب می شوند، در حالی که به نظر می رسد جدایه pxw3 جزء گونه ای دیگر از جنس سودوزانتوموناس باشد. جدایه str1 نیز گونه جدیدی از استنوترفوموناس می باشد. در ابتدا تصور بر این بود که جدایه های مزبور جزء جنس آزوسپیریلوم می باشند، لذا دو سویه آزوسپیریلوم برازیلنس sp7 (s1) و آزوسپیریلوم لیپوفروم (s2) به عنوان سویه های استاندارد انتخاب و با جدایه های مورد مطالعه از لحاظ پارامترهای بیولوژیک مقایسه شدند، اما آنالیزهای فنوتیپی و ژنوتیپی تأیید نمود که این باکتری ها آزوسپیریلوم نیستند. برای اولین بار در این مطالعه نشان داده شد که سودوزانتوموناس به صورت اندوفیت در ریشه برنج وجود دارد. به منظور تعیین نقش برخی آنزیم ها در ورود باکتری های مورد مطالعه به ریشه، فعالیت آنزیم هایی نظیر کمپلکس سلولاز، لاکاز، پکتیناز، فیتاز و آلکالن فسفاتاز و همچنین زایموگرام آنزیم هایی نظیر لاکاز، فیتاز و آلکالن فسفاتاز در جدایه ها و سویه های استاندارد مورد بررسی قرار گرفتند. در بین جدایه های اندوفیت برنج و گندم، یک جدایه از ریشه گندم و یک جدایه از ریشه برنج به دلیل رشد بیشتر در محیط های سلولز، کربوکسی متیل سلولز، سالیسین، پکتین، تری کلسیم فسفات معدنی و فیتین، به منظور مقایسه فعالیت آنزیم های تجزیه کننده دیواره سلولی گزینش شدند. هیچکدام از جدایه ها دارای فعالیت پکتیناز نبودند. استنوترفوموناس جداسازی شده از برنج به طور معنی داری دارای فعالیت کربوکسی متیل سلولاز و فیتاز بیشتری نسبت به جدایه گندم بود (به ترتیب 77/31% و 99/46 % بیشتر)، اما فعالیت آنزیم fpase در هر دو سویه تقریباً مشابه بود. بیشترین میزان تولید مربوط به سویه s2 بوده، ولی به طور کلی فعالیت فیتاز در جدایه های برنج بیشتر از گندم بوده است.دو جدایه str1 و pxw1 که جدایه های منتخب از نظر فعالیت سلولازی بودند، فعالیت فیتاز و همچنین رشد آنها روی منبع فسفات معدنی با هم مقایسه شدند. فعالیت فیتاز جدایه str1 در روز پنجم تقریباً به دو برابر جدایه pxw1 رسید. از لحاظ زایموگرام، فقط جدایه pxw3 حداقل یک ایزوآنزیم داشت. ویژگی فیتاز (از نظر بار و وزن مولکولی) در جدایه های مختلف متفاوت بود. تمام جدایه ها توانایی تولید آنزیم لاکاز را داشتند. از نظر فعالیت، جدایه pxr1دارای بیشترین و str1 دارای کمترین فعالیت بود. نتایج آزمایش زایموگرام نیز نشان داد که تمام جدایه ها این آنزیم را تولید نموده و تمام جدایه ها بغیر از جدایه s2 دارای حداقل دو ایزوآنزیم بودند. تمام جدایه ها دارای فعالیت آلکالن فسفاتاز بوده و به طور کلی جدایه های برنج دارای فعالیت آلکالن فسفاتازی بیشتری نسبت به جدایه های گندم بودند. کموتاکسی جدایه ها به تراوشات ریشه سه و هفت روزه برنج و گندم متفاوت بود. برخی جدایه ها به تراوشات ریشه سه روزه و برخی دیگر به تراوشات ریشه هفت روزه کموتاکسی قویتری نشان دادند. همچنین کموتاکسی متقابل بین جدایه های ارقام گندم و تراوشات ریشه برنج و بلعکس مشاهده گردید. هدف از این تحقیق بررسی برهمکنش دی ازوتروف های اندوفیت با باکتری سلولوموناس بود، لذا از سویه سلولوموناس اودا atcc 491 استفاده گردید. بسیاری از پارامترهای بیولوژیک نظیر تولید هورمون اکسین، توانایی تثبیت ازت و درصد کلونیزاسیون نیز در جدایه ها به تنهایی و توأم با سلولوموناس اودا atcc 491 مورد بررسی قرار گرفتند. جدایه های برنج نسبت به جدایه های گندم اکسین بیشتری تولید نمودند. به غیر از جدایه pxr2، مقدار تولید اکسین در تلقیح توأم سایر جدایه ها و سلولوموناس در مقایسه با هر یک از جدایه ها به تنهایی بعد از گذشت 72 ساعت بیشتر بود. زمانی که اثر عصاره فاقد سلول (فیلترات) کشت جدایه pxr1 (غلظت های 0، 2، 4 و 9%) روی رشد ریشه برنج رقم هاشمی مطالعه گردید، آنالیز آماری هیچ اختلاف معنی داری را بین تیمارها برای تعداد و همچنین وزن خشک ریشه نشان نداد، هر چند غلظت های 4 و 9% دارای تعداد و وزن خشک بیشتر بودند. اختلاف معنی داری بین تیمارها برای طول و وزن تر ریشه به ترتیب در سطوح 01/0=? و 05/0=? مشاهده نگردید. وقتی که تریپتوفان به عنوان سوبسترا برای تولید اکسین استفاده شد، بیشترین مقدار تولید اکسین در غلظت ppm 5000 و بعد از گذشت 72 ساعت بود (ppm 66/1671). وقتی عصاره (01/0 گرم) و تراوشات ریشه برخی گیاهان جایگزین تریپتوفان خالص گردید، بیشترین مقدار تولید اکسین ppm 3/141 بود که از تراوشات لوبیا و ترب بدست آمد. در بین عصاره ها نیز بیشترین مقدار اکسین ppm 270 و از عصاره برنج بود. وقتی از عصاره ریشه به وزن 04/0 گرم استفاده گردید، هیچ گونه افزایش در تولید اکسین مشاهده نگردید. تمام جدایه هایسودوزانتوموناس، استنوترفوموناس و سویه های استاندارد آزوسپیریلوم توانایی تولید آمونیاک را داشتند، طوری که توانایی تولید در بین جدایه های برنج و گندم تقریباً مشابه بود. سلولوموناس توانایی تولید آمونیاک را نداشت. از بین تمام جدایه ها و سویه های استاندارد، سلولوموناس توانست فقط به کلونیزاسیون سه سویه کمک کند. در آزمون برهمکنش جدایه ها با سلولوموناس، نتایج مقایسه میانگین ها بر اساس دانکن در ارتباط با گندم نشان داد که تیمارها در سطح 01/0> ? در وزن تر و تعداد ریشه اختلاف معنی دار نداشته، ولی در طول ریشه با هم اختلاف معنی داری دارند. میانگین وزن تر در تیمارهای سودوزانتوموناس با عدم فعالیت سلولازی توأم با سلولوموناس نسبت به سایر تیمارها بیشتر است. از لحاظ تعداد ریشه، میانگین تعداد ریشه در تیمارهای سودوزانتوموناس با عدم فعالیت سلولازی بیشتر است. نتایج نشان داد که سلولوموناس اودا atcc 491 باعث افزایش کلونیزاسیون سودوزانتوموناس و استنوترفوموناس بدون فعالیت سلولازی روی برنج و با فعالیت سلولازی روی گندم می شود. در این تحقیق برای اولین بار پارامترهای بیولوژیک گونه جدیدی از سودوزانتوموناس مورد بررسی قرار گرفت. برهمکنش موفق این باکتری ها با باکتری سلولوموناس، تلقیح توأم این باکتری ها را جهت افزایش موثر در پارامترهای کمی و کیفی گیاه مطرح می نماید و با توجه به برهمکنش موفق بین سلولوموناس با سه جنس باکتریایی، تصور و پیشنهاد می شود که برای تولید هر نوع کود بیولوژیک به جای استفاده از یک باکتری خاص کمک کننده، از سلولوموناس استفاده گردد.